科研中的miRNA研究方法總結(jié)    

microRNA(miRNA) 是一類長度在22nt左右的內(nèi)源非編碼小RNA，廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒等多種有機(jī)體中。1993年，Lee等人在秀麗新小桿線蟲(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)了控制著線蟲時(shí)序性發(fā)育的lin-4。2000年，Reinhart等發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA：let-7。隨后的幾年時(shí)間里，許多研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類RNA，并將這些具有時(shí)空表達(dá)特異性的非編碼小分子RNA命名為microRNA(miRNA)。  

從長的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的單鏈miRNA到與靶標(biāo)RNA結(jié)合，至少需要四步：先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8組成的復(fù)合物將初始miRNA 轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）加工成miRNA前體（pre-miRNA）；接著由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5和Ran GTP酶將miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；第三步是由另一種核糖核酸酶ⅢDrosha將miRNA前體剪切成成熟的miRNA雙鏈，miRNA雙鏈打開，其中一條進(jìn)入到RNA誘導(dǎo)的沉默RISC復(fù)合體（RISC）中，該復(fù)合體還包含TarRNA結(jié)合蛋白（TRBP）；終RISC復(fù)合體根據(jù)miRNA與靶標(biāo)RNA的互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行剪切，或者翻譯抑制。

  miRNA通過作用于相應(yīng)靶mRNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。預(yù)測超過1/3的人類基因都是保守的miRNA靶基因。近些年，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，大量的miRNA已經(jīng)被鑒定出來，截至目前發(fā)現(xiàn)的人的成熟的miRNA有2578條，小鼠的有1908條。雖然miRNA的數(shù)量很多，但大多miRNA的功能并不為人所知。因此，準(zhǔn)確快速地預(yù)測并鑒定miRNA的靶基因，對(duì)研究miRNA
的功能具有十分重要的意義。下面本篇文章將著重介紹一下在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中如何快速的鑒定與人類疾病相關(guān)的miRNA及其功能研究方法。  

一、miRNA的定量檢測  成熟miRNA的片段小，只有21bp左右，變異較大，在不同細(xì)胞中的表達(dá)差異較大，低表達(dá)的miRNA為其定量檢測帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，隨著科學(xué)的進(jìn)步，越來越多的miRNA檢測方法被建立起來，促進(jìn)了miRNA研究進(jìn)展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大miRNA定量檢測方

Northern blotting: 是較為經(jīng)典的檢測各組織和器官中RNA的量和大小及估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：①完整的RNA的分離；②根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離；③將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移過程中，要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布；④將RNA固定到固體支持物上；⑤固相RNA與探針分子雜交；⑥除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子；⑦對(duì)特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測、捕獲和分析。優(yōu)點(diǎn)：高度靈敏，而且通過結(jié)合RNA marker可以檢測出miRNA的片段大小，能夠排除實(shí)驗(yàn)被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting對(duì)樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。  微陣列芯片技術(shù)（microarry）：也稱生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技術(shù)，是一種平面的基質(zhì)載體，上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因的產(chǎn)物。當(dāng)與熒光標(biāo)記過的樣本雜交后，相應(yīng)位置熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可反映對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的豐度。其優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)檢測多個(gè)樣本的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)miRNA的高通量分析。但芯片檢測技術(shù)對(duì)miRNA的純度質(zhì)量要求較高，現(xiàn)行的RNA提取為了獲取高質(zhì)量了RNA，往往會(huì)在純化過程丟失掉許多小分子RNA，影響一些低表達(dá)RNA的檢測。另外芯片技術(shù)的一個(gè)突出的缺點(diǎn)就是信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差。這些方面都需要改進(jìn)。

原位雜交：該技術(shù)可以更為直觀的顯示出miRNA的表達(dá)情況，可直接觀測到miRNA的表達(dá)時(shí)間，表達(dá)分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測不同細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞中的miRNA表達(dá)，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平。但miRNA分子太小，要對(duì)傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)，增加雜交的親和性，結(jié)合牢固性，以防止洗脫過程中的丟失，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。  RT-PCR：與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏的檢測出低表達(dá)的miRNA，并適合于高通量篩選。由于miRNA分子片段小，研究者們通過對(duì)其反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)使得RT-PCR定量檢測miRNA成為可能，根據(jù)所用引物的不同可以將其分為兩大類，一類是Oligo d(T)特異的RT引物，miRNA在反轉(zhuǎn)錄前需要對(duì)其3’末端加多聚尾Poly(A)，再使用Oligo-Universal Tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA*鏈。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物由可以自身呈莖環(huán)狀的特異序列加上6個(gè)到8個(gè)miRNA3’端反相互補(bǔ)堿基組成，一條miRNA序列對(duì)應(yīng)一個(gè)特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。兩者相比，前者引物設(shè)計(jì)容易且檢測通量高，但檢測靈敏度和特異性比后者低。熒光定量PCR根據(jù)所用熒光來源不同可以分為SYBR Green染料法和TagMan探針法。  miRNA 深度測序：該技術(shù)能夠直接對(duì)樣本中特定大小的miRNA分子進(jìn)行高通量測序，可以在無需miRNA 序列信息的前提下研究miRNA的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒定新miRNA 分子。新一代測序常使用的3種平臺(tái)是Illumina的基因組分析儀、Roche454基因組測序儀以及 AB Life Technologies的SOLiD系統(tǒng)。因?yàn)閙iRNA的序列較短，較多應(yīng)用于miRNA檢測的新一代測序技術(shù)平臺(tái)為Illumina基因組分析儀和AB Life Technologies的SOLiD系統(tǒng)。Illumina基因組分析儀具有所需樣品少，數(shù)據(jù)誤差小，操作流程簡單等特點(diǎn)。SOLiD系統(tǒng)的讀長為35nt，且準(zhǔn)確度高，單次運(yùn)行所得的數(shù)據(jù)量大，特別適用于miRNA的研究。而Roche454基因組測序儀測序讀長可達(dá)400~500堿基，而miRNA序列長度僅為22堿基，所以該測序儀常用于新物種的基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，極少應(yīng)用于miRNA測序。